RNA-Seqのカウントって....どうする？

“ There are known knowns; there are things we know we know.
We also know there are known unknowns; that is to say we know there are some things we do not know.
But there are also unknown unknowns -- the ones we don't know we don't know."

これは2002年 2月12日、記者から、イラクにあるとされる大量破壊兵器がテロリストの手に渡ったという確かな証拠が無いことを指摘されて、これに答えたドナルド・ラムズフェルド国防長官（当時）の言葉です。

当時、あまりに意味難解な返答に、たくさんのコメディアンがジョークのネタにしていたことを覚えています。

既知なこと、知っていること、わかっていること。　これらが存在することを知っていること、わかっていること。

わからないことがあるということを知っていること。　あるいは知らないこと。

・・・哲学的ですね。　

これとRNA-Seqとが何の関係があるかというと、ノーマライズの方法について、知っていることと知っていると仮定していること、知らないこと、をちゃんと知っておく必要があるからです。

タグの数から発現量を算出する時の、RPKMという方法を以前書きました。

RPKMでは、タグカウントを、サンプル内の全カウントで割って、さらに転写産物の長さで割って、定数を乗じて、ノーマライズするのでした。
くわしくはWikiなどを参照。

ここで、
タグ（リード）数はKnownですか？
サンプル内総タグ数はKnownですか？
転写産物の長さはKnownですか？

Isoformの存在、未知Exonの存在などを加味すると、転写産物の長さは、厳密にはUnknownですね。　しかしこれをKnownと仮定して、計算します。
タグ数も、この仮定の転写産物の長さにマップされた数としてカウントされるのですから、厳密にはUnknownです。
こうなってくると、サンプル内総タグ数は、転写産物にMappableなタグという意味では、Knownとするべきでしょうか？

とは言っても、転写産物の長さを厳密に認識するのは、ショートリードでは不可能ですから、みなさんRefSeqなどで公開されている既知のmRNAの長さを用いるのです。　
でも頭のどこかに、これは仮定の長さかもしれない、と覚えておくのは意味があるでしょう。

さて、
複数サンプル間で発現量を比較したいとき、遺伝子の長さがとても影響するということがわかっています。
Oshlack et al., Transcript length bias in RNA-seq data confounds systems biology. Biology Direct 2009, 4:14.
 
転写産物が長い遺伝子ほど、異なるサンプル間で発現量の変動が大きく計算される傾向があるのです。
この論文では遺伝子の長さで補正していません。　発現変動の大きさと、遺伝子の長さをそれぞれ軸にプロットすると、発現変動の大きい遺伝子ほどmRNAが長い遺伝子だということがわかったそうです。

aとcがRNA-Seqのデータで、縦軸があるしきい値で発現変動ありとされた転写産物の割合（％）、横軸がその転写産物の長さ（bp）です。　bは同じくマイクロアレイのデータです。

RNA-Seqの「発現変動ありとする」やりかたに問題があるのは、長い遺伝子ほど変動ありとされている遺伝子の割合が高いことから、明らかです。

そこで、RPKMのように転写産物の長さで補正することが必要になるのですが、これまた、RPKMも万能ではありません。

つづく