メチレーションをダイレクトに検出するシーケンサー

シーケンサーは塩基配列を読むもの

というのはSanger型から始まってSolexa型、454型、SOLiD型、Ion Torrent型等、今までのシーケンサーの常識です。
でも、配列だけではなく、メチレーションの有無も同時に読んでくれたら・・・
これがPacBioではできる（らしい）のです。　

Flusberg et al. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing.
Nat Methods. 2010 Jun;7(6):461-5.
昨年のthe Advances in Genome Biology and Technology (AGBT)のポスター（実際には行っていないんですけど）から注目していたのですが、PacBioのSingle Molecule Real Time （SMRT）シーケンスを使えば、塩基の修飾も配列と同時に検出することができるようなのです。

SMRTテクノロジーについては以前、
PacBio　データの特徴　1　と　2　に書きました。

SMRTからの塩基配列データは、パルス　（4種類の異なる光）として出力されます。

（AGBTポスターより）

パルスから得られる情報には、塩基そのものの他にも、一塩基が読みとられる時のパルスの幅 Pulse width (PW) と、次の塩基が読みとられるまでのパルスの間隔 Interpulse duration (IPD) もあります。
このIPDが、塩基が修飾されていると変化するのです。
具体的には、Aがメチル化されている　N6-methyladenosine (mA)　の場合、Tと結合する部分のNにメチル化が起こっているため、Tと結合するのが遅くなるそうです。
そうすると、メチル化されたAのパルスの間隔　IPDが、メチル化されていないAと比べて大きくなります。　（下図の上がメチル化A、下がコントロールA。　メチル化Aの後、次のTまでの間隔が、コントロールのAからTまでの間隔と比べて大きいのがわかります）
この原理を用いて、メチル化されているアデノシン（に限らずシトシンも）を見つけよう！　ということです。

でもこの検出方法は、うまくいくのでしょうか？　

論文ではまず、人工的に作ったメチレーション配列とコントロール配列199塩基を、両方とも何百回も同じところを読んで、平均のメチル配列のIPDと、非メチル配列のIPDを比較しています。

これを見ると、必ずしもメチル化された箇所のIPDが大きく変化するわけではなく、その周辺の塩基のIPDがより影響を受けることがわかりました。

縦軸が塩基ごとのIPDの比（メチルサンプル/ 非メチルサンプル）の平均で、横軸が塩基のポジション、▲印がメチル化の場所です。

上からN6-methyladenosine、5-methylcytosine、5-hydroxymethylcytosine　の順で、それぞれN=346、504、393　だそうです。

どうでしょう？　メチル化された塩基の場所のIPDが変化しているものもありますが、その前後で大きく変化を示しているパターンのものもあるのがわかります。

N6-methyladenosineでは、メチル化塩基とその5番めの塩基

5-methylcytosineでは、2番、3番、6番めの塩基

5-hydroxymethylcytosineでは、2番、6番めの塩基

のIPDが大きく変化しています。　（縦軸の値が異なるのに注意）

このようなパターンがあることは、メチル化の種類も見分けることができる、ということです。

既存のバイサルファイト法のような形では不可能でしょう。

もちろん何百回も読まなくても、数回、しかし繰り返し同じ所を読むことで、メチル塩基と非メチル塩基を区別できるそうです。　

SMRTのCircular topology型DNAテンプレートなら可能なのです。

赤線がメチルAを含むテンプレート、青線がコントロールです。

5回読めばはっきりメチルテンプレートとコントロールの、メチルAのパルスが区別できることを示しています。

人工配列はもういい、という方のために、彼らはDNA adenosine methyltransferase positive (dam+)の大腸菌から取り出したC. elegans fosmid　配列をも読んでいます。

比較対象は、Whole Genome Amplification（WGA）したコントロール配列です。

これは3.7kbの配列にフォーカスして解析しています。

dam+ のIPDをコントロール（WGA）のIPDで割った、IPD Ratio　が縦軸です。

Aメチル化はGATC配列に起こりやすいので、non-GATCの塩基（○）とGATC塩基（■）を分けています。

N=106で、平均IPDをプロットしています。

全体的に、non-GATC塩基はIPD ratio が2以下なのに対し、GATC塩基（メチル化塩基）は、IPD Ratioが3から7の間にいるので、区別できる！　ということは言えるかな？

ちょっと2500塩基付近の下のGATCが微妙ですが。

実際、これからの技術ですね。

IPDの変化のパターンは、メチル化の種類にだけ依存しているのか、周りの塩基によっても違うのか、生物種によっても違うのか、光学的な条件によっても違ってくるのか。

でも、希望は持てます。　一度パターンがわかってしまえば、シーケンスするだけでメチル化の種類もわかってしまうのですから。