NGSでmicroRNA解析 1

microRNAというのは、タンパク質にはならない、いわゆる non-coding RNAの仲間です。　
それ自身で標的のmRNAの3’-UTRなどに結合し、標的mRNAを分解します。
microRNAは発現制御機能を持った、RNA分子なのです。

と、ごくごく簡潔にまとめましたが、microRNAについては、多くのレビューや教科書に記載がありますので、詳しくは書かないとして。　Wikipediaでもかなり情報が得られますよ。

さて、microRNAの解析は、長らく、TaqManアレイやその他のマイクロアレイ、PCRなどが主流でした。
近年、NGSでもこれを解析している例が見られます。
実験プロトコールとして一般的なのは、

1. トータルRNAを抽出して
2. ゲルに流した後18－30塩基のあたりを切り出し
3. Small RNAを精製して
4. ライブラリーキットにある通りアダプターを付け
5. cDNA合成し
6. ライブラリーをシーケンサーで短めに読む

というものです。

短めに読む、というのはフラグメントの長さが　18-30塩基を予想しているからで、35、6塩基も読めば十分全体をカバーするからです。
ゲノムや転写産物を読む場合は、できるだけ長く読めたほうが良いですが、microRNAは短くてもOK、むしろちゃんと正確に読めることが大切です。

さて、シーケンサーが無事データを出力しました。
ここからデータ解析です。

microRNAの解析では、リードのアダプタートリミングは大切です。　（microRNAに限ったことではありませんが）
読んでいるフラグメントの長さが短い分、5’側のアダプターから読んだ時に、フラグメントを読み切り、3’側のアダプターまで読んでしまうことがあるからです。
そのため、3’側のアダプターをトリミング（除去）することが必須です。

次に、トリミングした後のリードが、短くなりすぎると、後でマッピングする際にNon Specificにマップされる恐れがあるので、これも除きます。　15‐18塩基以下の短いリードは除去するといいかもしれません。

リードがきれいになったところで、いよいよマッピングです。　でも何に対して？

一例を示します。　今度参考文献も示しますね。

1. 先ずゲノムにマッピングし、マップされなかった配列はごみとして除去する
2. ゲノムに当たったリードを回収、miRBase の配列（precursor, mature, mature*）にマッピング
3. miRBaseの配列にぴったり当たったリードは、既知のmicroRNAとして保存
4. miRBaseの配列に当たらなかったリードは、次に、microRNA以外の、既知のnon-coding RNA （piwiRNA, snRNA, snoRNAなどの） 配列に対してマッピング
5. non-coding RNAにも当たらなかったリードは、念のため、RefSeqのmRNA配列に対してマッピング
6. それでも当たらなかったリードは、新規microRNA「候補」として保存

これにより、①既知のmicroRNA、②それ以外のnon-coding RNA、③新規microRNA 候補、の3種類のデータセットができる。

既知のmicroRNA、non-coding RNA については、発現量の解析をすることになるでしょう。
新規候補の解析は、少しやっかいだが、アルゴリズムが無くはないのです。

つづく