NGSでmicroRNA 2

前回はNGSでmicroRNAを読むときの一般的なワークフローで、マッピングまで書きました。

既知のmiRNA配列にマップしたときは、その発現量がマップされたリードの本数で表現できる、ということは直感的にわかるでしょう。
以前、RNA-Seqの発現量推定のところでも書きましたが、リードの数はサンプルごとのノーマライズ（正規化）が必要です。

（その既知miRNAにマップされたリードの本数）/ （そのサンプルランで取れた全リードのうちmiRNAにマップされたリードの合計数）

出力されたリードの数、特にマッパブル（Mappabl）なリードの総数は、サンプルによって異なります。　ですから、各miRNAにマップされたリードの本数を全体で割ってあげて、異なるサンプル間で比較可能にするのです。
分母を、そのサンプルのリード本数全体　として計算している方もおられますが、私は、マップされたリード本数全体　とした方が精度が上がると考えています。
だってマップされないリードまでノーマライズの分母に含めるのは不自然でしょう。

これだけでは値が非常に小さくなるので、100万倍して、RPM（Read Per Million）という表現にするのが良いかも知れません。

さて、そうして正規化された値は、当然ながらmiRNAの発現量そのものではありません。
あくまで比です。
ということで、この値は、ほかのサンプルの正規化miRNA発現値と比較して、何倍発現量が多い、少ない、というような解析に持っていきます。
マイクロアレイと同じですね。

Nが3以上あれば、正規化後の値を対数変換してから、通常の統計手法（T‐Testなど）で比較すると良いでしょう。

DESeqという発現量比較のツールも使えるかと思います。
いろいろ調べてみると結構miRNA関連論文で、このDESeqが使われています。　
元々は発現変動遺伝子を解析するツールです。　
遺伝子は全部で数万あり、その中でほとんどは変動していない、という仮定の下、変動有意遺伝子を見つけるわけです。
microRNAは全部でもたかだか数百、これで遺伝子発現と同じモデル（負の二項分布）式を使っても良いのか、という疑問は残りますが、ここではそれを置いておくとして。

Nが1しか無い場合、割り算して比較するしかありませんね。

有意な発現変動を示したmiRNAが見つかったら、そのターゲット遺伝子を探してみましょうか。
データベースとしてはまず、miRBase (http://www.mirbase.org)がいいでしょう。

ここからはTargetScan や Pictar　といった、ターゲット予測プログラムのサイトへもリンクできます。
ターゲット遺伝子を見つけたら、その遺伝子のGO（Gene Ontology）を検索して、どんな機能の遺伝子がターゲットになっていたのか、を調べることも良く行われます。

さて、これら以外に、NGSならではの解析とは何でしょう？

そう、既知ではなく、未知のmiRNAを見つけることです。

それには先ず、マッピングのデータから、既知miRNA以外の場所にマップしたリードが作っている、ある程度の長さのクラスターを見つけてこなければいけません。
ある程度の長さって、どれくらいだ？
クラスター配列は、2次構造を取り得る、いわゆるpalindromicの配列でなくてはなりません。
1次元で言うと、（mature miRNA配列）＋（ループ構造）＋（mature* miRNA配列）のパターンである必要があります。
そのような配列を取ってきたら、エネルギーが最小になるようなときにちゃんとヘアピンのようにフォールドするかどうか、を確かめます。
さらに、Droshaなどのタンパク質に切断されるサイトがあるか、調べます。

これを全部プログラムを作って行うのは大変ですが、幸い、アカデミックの方ならフリーで使えるツールがあります。　miRDeep というものです。

このドラえもんの手、みたいなのがmature miRNA-Loop-star の2次構造で、薄い線がマップされているリードです。　
matureの方により多くのリードがマップされているのは、より本物らしいmicroRNAだったことを裏付けます。

残念ながら、企業はフリーじゃないんですよね。　いくらか払うのかな。

2次構造だけの予測なら、できるソフトもありますが、miRDeep ほど特化しているものは少ないでしょう。　チャンスがあれば使ってみたいです。


microRNAをNGSで解析するというテーマで、よくまとめられているレビューがあるので紹介します。
Motameny et al. (2010) Next Generation Sequencing of miRNAs - Strategies, Resources and Methods. Genes. 1, 70.

こちらはmiRanalyzerというツールのワークフローです。フローは参考にしています。
Stark et al. (2010) Characterization of the Melanoma miRNAome by Deep Sequencing. PLoS One. 5, e9685.

発現量比較から新規miRNA予測、ターゲットのGO解析まで行った例です。　こちらも良い。
Dhahbi et al. (2011) Deep Sequencing Reveals Novel MicroRNAs and Regulation of MicroRNA Expression during Cell Senescence. PLoSOne. 6, e20509.