NGS解析有償ソフト： 買う価値はあるか (前編)

「無い！」
と自信を持って言った方は、相当バイオインフォに強いか、フリーツールを熟知しているか、そういうツール自体が大好きか、あるいは前に痛い思いをしたか、でしょう。

 

私は立場上、「無い」とは言えませんし、実際お金で解決できることもあるのは事実です。
大抵の有償ソフトはGUI、つまりグラフィカルに操作でき、難しいコマンドラインは必要ありません。
NGS解析は面倒で大掛かりだ、という先入観を見事に打ち砕いてくれます。
ドライの研究者向けではなく、ウェットの研究者向けに設計されているからです。

 

フリーのツールはLinux、コマンドライン、自己責任、といういばらの道が存在し、慣れればそれで楽しいのですが、ウェット研究者にとって敷居は決して低くありません。
そんな時にふと出会った有償ソフトは、その昔、Windows95が登場したときのような、NGS解析でのPlug and Playを見事に実現してくれる！　ように映るのです。

 

しかし、です。
NGS有償ソフトは、全てのNGSウェット研究者に普及させるため、わかりやすく、使いやすい機能を載せました。
当然ながら、NGS有償ソフトは売って利益を出さなければいけませんから、最も良く使われるであろう機能から順番に、製品開発リストに取り入れてきました。
できるだけ多くの顧客を獲得するため、できるだけ多くの解析手法は取り入れたい。
しかし開発コストとの兼ね合いから優先度を付け、有名な解析手法は必須とし、マイナーなもの、解析手法が複数あるもの、まだ新しくて一般的では無いもの、は後回しにする。

 

そうすると、どのソフトも皆、RNA-Seq、ChIP-Seq、SNV-InDel、という良く使われるアプリケーションを搭載することが大事になります。
他社との差別化には、ビューワーや、外部データとのリンク、関連遺伝子の機能検索、フリーツールとの融合、という、NGS解析の本筋とは別のプラスαで勝負することになります。

 

誤解の無きように言うと、有償ソフトでは、NGS解析の本筋でも差はあります。マッピングの速さとか、SNP検索のアルゴリズムの違い、の違いなどです。
しかし、他社製品との大きな差は、今やアルゴリズムというよりも、

1. 解析の進め方や見せ方、結果出力の簡単さ
2. マイクロアレイなど他の実験結果との統合
3. 検出した発現量やChIP-PeakやSNPなどからバイオロジカルな意味づけ

 

といった、3次解析以降の部分に開発力を注いでいるように思います。
有償ソフトの購入を検討されている方は、RNA-Seqができる、ChIP-Seqができる、という謳い文句ではなく、どう表示されるのか、その後は何ができるのか、プラスαの解析にはどんなものがあるか、という点に最大の関心を持って頂けると判断しやすいと思います。　
これだけ研究目的が多岐に渡るNGS解析は、自分の目的に合わなければ買う価値はありませんが、ぴったり合うのもまた無いと思った方が良いでしょう。

 

そんな有償ソフトで最近、気になっているものがあります。
偶然私の知り合いが米国でセールスをやっていることを知ったのですが、日本ではAgilent社がAvadis NGSという名前で取り扱っています。

 

http://www.avadis-ngs.com/features/introduction

 

中編につづく・・・

SAMMate : RNA-Seqの解析簡単フリーツール

SAMMate (http://sammate.sourceforge.net/) というフリーの、RNA-Seq解析ツールがあります。
これは、Windowsで動きます。　GUI自体も難しい操作は必要なく、非常にシンプルです。
僕はこういうソフトが好きです。

先ずは上のサイトからEXEをダウンロードしましょう。　WinもMacも今最新のがv2.5です。
適当なフォルダ内で解凍すると、こんなファイル群ができます。

SAMMate.exeをダブルクリックすると、起動します。
起動しない時は、必要なバージョンのJavaが入っていないせいかもしれません。詳しくは先のサイトからダウンロードできるManualに書いてあります。
起動するとこの画面が出ます。

SAMMateを使うには、
1．SAMフォーマットのマッピングファイルと、
2．マッピングに使ったゲノムのGTFアノテーションファイル
が必要です。

例えばUCSCのHG18をリファレンスにBowtieか何かでマッピングして、SAMファイルを作る。
そのゲノムに合ったGTFフォーマットのアノテーションファイルを、ダウンロードしてくる。

SAMファイルとGTFファイルを同じディレクトリに入れて、SAMMateからその場所を "Open" します。
そして、その2つのファイルを右クリックして　"Working Space" に移動します。
あとは、 "Run"　するだけ。

デモデータも用意されています。　"examples" のディレクトリを開いて、とりあえず2つのファイルをWorking Spaceに移動してRunしてみましょう。

結果はこんな感じのリストです。

これは遺伝子の発現を示したリストです。　詳細説明はマニュアルに任せるとして、転写産物ごとのリード本数、FPKMなどが計算されています。

デモデータではない、実際のNGSデータをUCSCのゲノム配列にマップした2GbくらいのSAMファイルと、70MbくらいのGTFファイルを使ってSAMMateをRunしたところ、メモリ3Gb、Windows7の私のPCで約20分かかりました。　計算中は他のソフトはほぼ動きません。

SAMファイルを入れていたフォルダには、遺伝子の発現値がExcelでも保存されています。

あと、Wigファイルというものも作られます。
これは、UCSCのゲノムブラウザ上に表示することのできるファイルフォーマットです。
Custom Trackという機能を使うと、このwigファイルを表示することができます。

この絵の一番上の山みたいなグラフがwigファイルの表示結果です。　発現量を示しています。
すぐ下のmRNAのExonの場所とほぼ一致するのがわかりますね。

SAMMateにはあと2つ、シンプルな機能があります。
SAMのソートと、SAM <--> BAM 変換です。
これも、SAMtoolなどでもできるのですが、コマンドラインが嫌いという方でも簡単にできるのがいいですね。

最初にも言いましたが、こういうシンプルなソフトは大好きです。
ひとつのソフトにあまり多くを期待するな！　という作者のポリシーが見えてきそうです。

大容量配列データのやりとり

以前、シーケンスデータのサンプルを得るには、NCBIのSRA（Sequence Read Archive）が便利、というようなことを書きました。　（EBIやDDBJからも落とせるんですがそれはさておき）
ところが今SRAにログインすると、こんな画面が出てきます。

「SRAはまもなく新規データの登録を停止する。　このデータベースも連邦政府の予算削減のあおりを受けて、無くなるかもしれない。」
2月17日から、この画面です。　
データベースが無くなってしまうのか、とNCBIに問い合わせても、「現状はアナウンスと変わらない、つまり全ては予算しだい」という答えが返ってきました。

NGSのデータは1ファイル10Gbを超えるものもざらなので、これではいくら容量があるストレージサーバーを用意してもきりがないのでしょうね。　ペタバイト、エクサバイト・・・。　一昔前ならSFにしか出てこないような単位が必要かもしれません。

そんな中、個人的に注目しているのは、今さらですがP2Pのデータやりとり。
ファイル交換です。
NCBIみたいな所が一括して管理するのではなく、さまざまな研究所・大学単位で自分たちのでかい配列ファイルは保存しておいて、ファイル交換ソフトを使って欲しい時に取得するというもの。

ITに詳しい人はとっくに知っているでしょうが、BitTorrent というファイル転送プロトコルがあります。
詳しくはここのウィキを参照。
BitTorrentを使ってのファイルのダウンロードの仕方はちょっと変わっていて、
1．トラッカーサイト（ファイルの目次みたいなリストがあるサイト）から目的のファイルのトレントファイル　.torrent を落とす
2．ローカルPCに予めインストールした専用ソフトを使って .torrent ファイルを元に、本体データを落とす
です。

このプロトコルは、人気のあるファイルほど高速にダウンロードできる、という特徴があります。　
理由は、BitTorrentはファイルをダウンロードする際、自分の持っている（ダウンロードした）ファイルのピース（部分）をアップロードする決まりになっているからです。
つまり、人気があるからといって待たされることはありません。

もうひとつの特徴として、匿名性が無いことです。　誰が何のファイルを共有しているか、わかるしくみになっています。
この利点として、非合法なファイルを共有したらすぐにわかるので、我々健全な市民にはありがたいことです。　
そのせいか、多くの海外企業がファイル共有に採用しているそうです。
合法的なファイルなら、これをサイエンスコミュニティに導入したらどんなに便利でしょう。

Bioのデータも、これからはBitTorrentファイル交換によってやりとりしようぜ！　
http://extratorrent.com/article/459/biotorrent+now+bittorrent+is+used+for+scientific+purposes.html

ここで話題になっている、BioTorrent（BitTorrentと名前が似ていて紛らわしい）というサイトを見てみましょう。
http://www.biotorrents.net/browse.php

シンプルな作りです。
Genomicsというチックボックスが気になります。
ここをクリックします。

イルミナシーケンサーからの配列ファイル名が出てきました。
ここのリンクをクリックすると、.torrent ファイルを落とせます。
その後自分のソフトを使って、ファイルを共有しているみんなから、ファイルのピースをダウンロードして配列ファイルを得るのです。
ちなみに、このサイトを使用するにはサインアップが必要です。

試しにダウンロードしてみました。　バクテリアサイズのParied-Endイルミナシーケンスファイル268Mb、解凍すると800Mb近いFastqファイル、が数十分で落とせました。

BioTorrentへの登録数はまだまだ少ないです。
これから増えていくのでしょうか。　あるいは他の、もっとたくさんのデータメニューをそろえたトラッカーサイトができるのでしょうか。
注目しています。

Accelrys Partners with Oxford Nanopore

Accelrys といえば、バイオの研究者よりもケミカルの研究者に良く知られているかもしれませんね。
Pipeline Pilot というソフトウェアが有名です。　画面（デフォルト）はこんな感じです。

このソフトは、パイプラインと呼んでいる通り、解析の流れを先ず作ります。　GUIで作ります。
「解析の流れ」は様々なパーツ(コンポーネント)を組み合わせて作るのですが、一度作ってしまえば何度も解析のバッチ処理ができ、同じ作業を何十回もやらなければいけない時などに便利です。
で、このパイプラインにはオプションで、シーケンス解析のパーツがあるのです！！　

このAccelrys社と、1分子シーケンサーのOxford Nanopore社が、パートナーシップを結んだそうです。
http://ir.accelrys.com/releasedetail.cfm?ReleaseID=557883

Oxford Nanopore社のテクノロジーは、他のどのシーケンサーとも変わっていて、ナノポア（小さい穴）の中を分子が通過するときの電荷を検出して、1分子単位で物を測るというものです。
今はNGS、DNAシーケンサーとして開発しているようですが、分子は何もヌクレオチドである必要は無いわけで、タンパク質でも化合物でも可能でしょう。
そんな将来性の高さが、Accelrysとのパートナーシップにつながったのではないでしょうか、というのは私の勝手な想像です。

Nanoporeシーケンサーは、まだリリースされていないようですが、技術は期待大ですね。

さて、最近、Accelrys社のWebinarがありました。
日本時間の24日深夜0時半から、でしたが、内容はずばりPipeline PilotのNGS Collection

今日はこれを紹介します。　　

Pipeline Pilot NGS Collection 

NGS Collection は、アセンブル、マッピング、SNP/InDel/CNV検出、アノテーション、RNA-Seq、ChIP-Seqといったメジャーな解析機能はあるようです。
これらの解析機能を並列に実行できて、例えばマッピングなら異なるアルゴリズムを並列に実行し、結果を比較することができます。
アノテーションDBと連携させて、検出したSNPがどの遺伝子にあるのかわかります。
ビューワーはGBrowse2で見ることも、リストでみることもできます。
SAM/BAM, GFF3/Tabix, XML で出力できます。

リードを取り込んで、マッピングして、SNP検出して、それぞれでレポートして、SNPがあれば遺伝子のどこにあるか、それをGFFで出力、またはHTMLで表示、・・・　などという一連の流れ（パイプライン）を設計して実行！　
そんな説明とデモを見ました。

パイプラインの様子（MAQとSOAP SNPを並列処理）

SNPのリスト表示

ベン図で表示

私の印象では、ありきたりの有名なアルゴリズムはメニューにあるものの、マイナーな、というか
難しい、転座解析やバイサル解析はどうだろう？　もっと見てみたい。
リスト表示やエクセルでできるような統計は簡単にできそうですね。
レポート表示は充実しているようです。

今度、トライアルをする予定なので、またご報告を。

参考資料です。　興味のある方はどうぞ。

Next Generation Sequencing Collection Overview：　http://accelrys.com/products/datasheets/next-generation-sequencing.pdf
Building Novel Applications with Pipeline Pilot to Drive Next Generation Sequencing：　http://accelrys.com/resource-center/case-studies/pdf/oxford-nanopore-case-study.pdf

半導体シーケンサ Ion Torrent PGM™

東日本大震災で被災された方には、心からお見舞い申し上げます。

私はその時、東京オフィスで仕事中でした。　職場のビルはかなり揺れ、ロッカーは倒れ書類が散乱しました。　

その後、都内の電車が全部ストップしたため、19kmを4時間かけて歩いて帰宅しました。　寒かった。
東京は、震度5でしたが、インフラがやられると大変だとつくづく実感しました。

その日の午前中は、ライフテクノロジーズ社の、半導体シーケンサIon Torrent　PGMのショートセミナーに参加していましたので、今日はそれについてご紹介します。　

PGM（Personal Genome Machine）は、DNA合成時に放出される水素イオン（プロトン）をモニタリングして、配列を読みます。　

詳しくはこちらのサイトを見るのが良いでしょう。　カタログもダウンロードできます。

http://www.appliedbiosystems.jp/website/jp/product/modelpage.jsp?BUCD=138106&PLCD=138105&MODELCD=138098&MODELPGCD=138119

簡単にまとめると、200bpに断片化されたDNAは、SOLiDと同じように直径0.8ミクロンのビーズに吸着され、エマルジョンPCRで増幅されます。　

半導体上のウェルの表面には小さな穴が無数にあり、その中にビーズが入ります。

プライマーとDNAポリメラーゼによって、その穴の中でDNA合成反応が進むのです。

その時に一度に一種類のdNTPが流され、一塩基合成、プロトン検出の後、Washされます。次に別の種類のdNTPが流され、一塩基合成、プロトン検出の後、Washされます。

同時に反応に使われるのは一種類の塩基のみ、というのが重要です。

私も最初、プロトンの検出では塩基の種類がわからないじゃないか、と思ってました。

でも、一度にAだけを流すと、鋳型のDNAでAがくるべき時は反応が進み、プロトンが放出されます。つまり、今プロトンが検出されたビーズのDNAの塩基は、Aであるとわかります。　T、G、CがくるべきDNAテンプレートではDNAは合成されないのでプロトン放出は起こりません。

そして、きれいにWashされます。

次に、一度にTだけを流すと、同じくプロトンが放出されたビーズのDNAの塩基は、Tだということがわかります。T以外ではプロトン放出は起こりません。
Tが2つとりこまれたときは、電荷が2倍となるため、Tが2つあるとわかります。　
言葉で書くと回りくどいですが、先のサイトを見れば一目了然でしょう。

シーケンスはこれを数百回繰り返し、塩基を読みます。　

ちょっと、Rocheのパイロシーケンスと似ています。　（開発者は454の開発者でもあるそうです）

でも、違う点は、パイロシーケンスは、プロトンではなくPPの放出とその蛍光を読んで塩基を特定するところです。

さて、DNAを最初にフラグメント化するときの、長さは現状200塩基で固定です。　これ以上の配列は今は読めません。　将来的には、ソフトウェアの向上などにより400まで読めるようになるそうです。

装置は61 cm x 51 cm x 53 cm、のベンチトップ型で、とても小さい印象です。　プリンターほど？

装置価格　998万円　（←1000万円を切る）

1ランあたりのコスト　約6万円　（今のバージョン314のチップ価格）

チップを交換することでバージョンアップ！

現バージョンのチップの名前は314チップと言います。

平均リード長は100 bp、出力は10万リード、反応は2時間くらいかかります。

次期バージョン316チップ：平均リード長100 bp、100万リード、反応2時間半くらい

来年バージョン318チップ：平均リード長400bp、500万リード

これらのチップを交換することで、装置の買い替えはすること無しに、バージョンアップが可能です。

ちなみにこれらチップは使い捨てです。　

出力データは塩基のテキストデータ

Torrent Suitというベースコールマシンによって、最初1ランあたり53GBのDATデータは、180MB程度のsff、または60MB程度のfastqフォーマットで出力されます。

このマシンは、1台で複数のPGMのデータを処理できるそうです。

塩基配列で出てきます。　カラースペースではありません。

今後の予定

現在は微生物、ウイルスのデノボまたはターゲットリシーケンスや、アンプリコンシーケンスに用いられているそうです。

また、現在はシングルリードのみに対応ですが、今年中にはペアエンドに対応予定です。

そのうちバーコードサンプルにも対応するそうです。

ケーススタディの紹介では、ピロリ菌のゲノムシーケンスにて、GC%が高いところもちゃんと読めるらしいことがわかりました。

また、ホモポリマーが長くても、その数まで正確に読めるらしいです。

スタート時に必要なゲノム量は5マイクログラム、と結構多い？ですかね。

将来的には、1Gbのゲノムも読めるようになるので、他のシーケンサーとの差がますます小さくなりますね。

注目です。

革新的企業トップ50

今週のMIT, Technology Reviewに、「The 50 Most Innovative Companies 2011」という、記事がありました。　
Innovative＝革新的な　企業トップ50　ですね。　http://my.technologyreview.com/tr50/
　

この中には、今映画でも話題になっているFacebook、初めてAndroid OSを取り込んだ携帯を作ったHTCなど、今話題の急成長企業も入っています。

電子ブックKindleをヒットさせたAmazon.com、iPadで大成功したAppleなど、誰もが知っている名前もあります。

日本企業では、電気自動車リーフを発売したNissan、ハイブリッドカーで世界をリードするToyota の2社がランク入り。　リコール問題でさんざん叩かれたのに、やっぱり革新的技術はきちんと評価されていたのです。

バイオ企業はどうでしょう？

2009年にGenentechを買収したRocheは、昨年6億ドル以上を稼いだ抗がん剤Avastinをはじめ、分子標的薬のリーダーとしてランクイン。

他にはこんな企業が。

Claros Diagnostics：　一滴の血液でがんの診断ができる機器の開発。アフリカでHIV検査などを実施。前立腺がん診断機器はEUで承認済み

Cellular Dynamics International：　ヒトiPS細胞をスクリーニング用に大量作製し、製薬企業に販売するビジネスモデルで大成功

BIND Biosciences：　抗がん剤を腫瘍に直接届ける、いわゆるドラッグデリバリー技術の開発。　将来性が高いとしてランクイン

Synthetic Genomics：　創立者のひとりは、あのJ. Craig Venter （10数年前、ヒトゲノムプロジェクトに一企業（Celera Genomics ）として挑戦）。　藻類からエネルギーを取り出す技術を開発。　エクソンモービルもこれに参加。　石油に代わる次世代エネルギーとして、オバマ政権も注目。　

技術自体は日本にもあると思うんです。　ただ、それをビジネスに持っていく力は、アメリカはさすがですね。

忘れてならない、次世代シーケンサー関連企業もランクインしています。

Life Technologies：　SOLiD、と言いたいところですが、昨年買収したIon Torrent のデスクトップ型半導体シーケンサーが理由でランクイン。　一台5万ドルという値段は画期的な安さ、という。

Pacific Biosciences：　初の第3世代一分子シーケンサーがその理由。　昨年、数箇所に導入されているそうです。　昨年の論文では、ハイチで大地震の後に大発生したコレラのゲノムを読んで、ハイチコレラは中南米の他の地域で流行ったコレラ菌より、東南アジアの系統に近いことを発表していました。　

Complete Genomics：　世界的な遺伝子解析受託会社。　2005年設立で、SNPなどのジェノタイピングサービスは、23andMe、DeCODE 等の遺伝子テスト会社が有名ですが、ここはゲノムを読むことまでサービスとして行っています。　アカデミック寄りでは1000人ゲノム計画にも参加しており、60人分のヒトゲノムを公開しているそうです。 昨年、NASDAQに上場しました。

日本企業でバイオ関連の革新企業は残念ながら入っていませんでした。
製造業でも世界一の日本企業はありそうな気がするけど、「世界初」とか「革新的な」とかには、日本企業は慎重なんですかねえ。

ChIP-Seqで量的解析は可能か

SEQanswers で面白いトピックがあったので紹介します。
ChIP-Seqをやったとき、例えばChIPを2つの異なるセルタイプで行って、マッピング後、FindPeaks等のPeak Detectionソフトを使ってそれぞれPeakを検出したとします。
InPutも2つのセルサンプルに対して使用しています。　
結果、2つのサンプル（AとB）に対してそれぞれ、Peakがたくさんある状態です。

さて、サンプルAでは、ゲノムのある場所で、100リードからなるPeakが検出されました。
サンプルBも、Aとまったく同じゲノムの場所に、200リードからなるPeakが検出されました。
FDR、p-value等の条件は、ほぼ同じです。
このとき、サンプルBのこの場所は、サンプルAより2倍、タンパク質がDNAに結合しやすい、と言えるでしょうか？

テストの問題にいいですね。

ちょっと考えてみましょう。

リードの本数は、タンパク質の結合しやすさに関係するのでしょうか？

そもそもリードの本数は、実験によって異なります。
RNA-Seqの場合、発現量を計算するとき、実験で得たリード本数全体を考慮してノーマライズする方法があります。　マイクロアレイでも発現値をグローバルノーマライズやMedianノーマライズをしますよね。　全体の発現量が大きいアレイと、小さいアレイとを、同等に比較するためです。　テクニカルな、実験的なアーティファクトを除去するのです。

話を戻すと、出力されるリードの本数の総数は、サンプルAとサンプルBで異なるはずです。
もし、サンプルAからは1000万本のリードが出力され、サンプルBでは4000万本のリードが出力されていたとします。極端な例ですが。
では、ゲノムの同じポジションで検出されたPeakを構成するリードの本数、A: 100本、B: 200本に、どれだけの差があるでしょうか。
Bのほうが、このPeakあたりのリードの本数率（というのをあえて計算するならば）は低くなりますね。
A: 100/1000万、B: 200/4000万

実はこれはナンセンス、だと思います。
だって、検出されるPeakの数は普通、同じじゃないから。

この実験で用いたタンパク質は、サンプルAではゲノムの1000箇所に結合し、サンプルBでは2000箇所に結合したとします。
実験で得たリードの総本数は1000万本で同じとしましょう。
ほかの条件も同じと仮定すると、Aの1Peakあたりのリード本数は、Bの1Peakあたりのリード本数より、多くて普通と想像できませんか？

では、このタンパク質が、サンプルAでゲノムの1000箇所に結合し、同じくサンプルBでも1000箇所に結合した、とします。
その1000箇所がまったく同じであることはまず無いでしょうが、500くらいは同じ場所に結合するかもしれません。
リードの総本数も、ABともにほぼ1000万本で同じとします。
さて、この場合、500の箇所に関しては、Peak構成リードの本数で比較ができそうです。

Aの500箇所は平均100本のリードによってPeakが作られている。
Bの500箇所は平均200本のリードによってPeakが作られている。
よって、Bのサンプルでは、Aより2倍、タンパクが結合しやすい。

うーむ・・・。
なんかしっくりきません。

500箇所全部ではなく個別で見ても同じでしょう。
500箇所のある場所　A：100リード、B: 200リード　（Bが2倍結合しやすい）
また別のある場所　A: 200リード、B: 50リード　　（Aが4倍結合しやすい）　…　続く
こんな風に、Binding箇所を個別に見て、AとBのリード数を比較してタンパク質の結合のしやすさを判断することが可能でしょうか？

いいえ。共通する500以外の、共通しない500のPeakを考慮していません。どれだけの本数のリードが、共通しない500Peakに使われているでしょうか。

私が知る限り、現在のChIP-SeqのPeak検出アルゴリズムでは、異なるサンプル間のタンパク結合のしやすさを評価することはできません。
少なくとも、今のアルゴリズムで検出されたPeakを、リードの本数をもとに比較することはできないと思います。
近い将来、2つ以上のサンプルで検出したChIP-Peakから、何らかの量的解析をするアルゴリズムが出てくるかもしれませんね。