MiniSeq !? MiSeqの立ち位置は？

前回、学会の期間中は新製品の発表が良くある、って書きましたが、なんとイルミナから出ました。
その名もMiniSeq

ぱっと見、NextSeqに似ていますが、サイズはMiSeqよりも小さいようです。

そして使い勝手が良くなったとのこと。

スペック的にはMiSeq v2とあまり変わらない。

Specification Sheetから抜粋

High outputモードでのスループット

• 2x150bpが、24時間でアウトプット6.6～7.5 Gb
• 2x75bpが、13時間でアウトプット3.3～3.75 Gb
• 1x75bpが、7時間でアウトプット1.65～1.875 Gb

Med-Outputモードでのスループット

• 2x150bpが、17時間でアウトプット2.1～2.4 Gb

今はまだリサーチオンリー機器なので、そのうち、MiSeq Dxのように、MiniSeq Dxなんてのが出てくるんでしょうね。

そうするとMiSeqの立ち位置は？

MiniSeq

分子生物学会 in 横浜

例年通り、分子生物学会に来ています。
展示会のブースに立っていて、色んな人と話をしました。

やっぱり次世代関係の質問は多いです。
昨年に比べて3、4倍くらい、質問がきます。
やってみたい、というひとを入れると10倍くらいに増えているような感じです。

私のブログを見てくれているひともいました。
「もしかしてブログの・・・」　って言ってくれたひとも。　うれしい。

ポスターも、NGS関連が多くなってきたと実感します。


来年の、「NGS現場の会　第二回研究会」のチラシです。

行かれる方も多いのではないでしょうか？
この分野はまだ始まったばかりですので、手探り状態で実験・解析をしている方が多いのではないかと思います。
「現場の会」のようなところで、意見交換、質問、発表をすることは良いでしょうね。
NGS専門の学会が、日本にはありませんから。
私も来年、行きます。


それにしても横浜は疲れる。
私の家は東京の板橋区なんですが、三田線、東横線、みなとみらい線と乗り継いで、会場のパシフィコ横浜までドア・トゥー・ドアで約2時間。
往復4時間はしんどいです。

神戸が会場の去年は、泊まりだったから、ホテルに帰ってもまだまだ元気だったのに・・・。

Optical Mapping って

RNA-Seqの続きを書く予定でしたが、ちょっと寄り道して、別なことを。

只今、CBI学会（Chem－Bio Informatics学会）に来ています。
日立ソリューションズのブース＆プレゼンで、面白い技術を見つけました。
Optical Mapping　というものです。

アメリカでは数年前から導入されていたようですが、このたびマシーンが完成して日本では初めて発表されました。
その名も「全ゲノムソリューション」　
外挿遺伝子やリピート領域の同定、ゲノム構造の解析、高精度な菌株同一性に威力を発揮するといいます。

OpGEN 社のテクノロジーは、簡単に言うと全ゲノムレベルで制限酵素のマップを作ることにあります。
測定原理は、

1.  菌体から長い（200kb以上必要だそうです）ゲノムDNAを抽出し
2. ガラス基板上に並べて固定し、 
3. 制限酵素（1種類）でDNAを切断し
4. 蛍光により切断断片の長さを測定
5. 制限酵素マップをもとにアセンブルして、全ゲノムの制限酵素マップを作る

というものです。
詳しくはこちらのページ
DNAを基板に固定してから制限酵素で切っているので、ばらばらにはならず、Cuttingの位置情報が得られる、というのが重要な点です。

制限酵素のマップを作って、これが次世代シーケンサーの解析にどう役立つかというと、今までのショートリードによるde novo アセンブルは、どうしてもうまく読めないところや、リピートや外からの挿入遺伝子配列などがちゃんとつながらない、という問題がありました。
コンティグはできてもそれがつながらないということです。

それを補正する形で、あらかじめ制限酵素マップという物理的な地図を作り、これをもとにしてアセンブルしたときのコンティグをアライメントしていく、というのがこの技術の良いところです。

Optical Mappingでは、制限酵素のマップはできますが、これには塩基情報はありません。
あるのは一つの制限酵素が切った場所、の情報です。
では、どうやってこの制限酵素マップと、NGSからの配列情報、de novo Assemblyで出来たContigをアラインさせるのでしょうか？

答えは単純でした。
ある一定の長さを持つContigの中の、制限酵素Cutting部位を検索し、Contigひとつひとつに制限酵素マップをつくります。　これは付属のソフトで出来るそうです。
このContig内の制限酵素マップを、Optical Mappingで求めた全ゲノムマップに対してアラインしていくと、Contigに含まれる配列情報が全ゲノムマップに反映される、ことになります。

普通のNGSの感覚では塩基配列を基にアラインすると思ってしまうのですが、これは制限酵素のマップ（Cuttingの場所情報）を基にアラインするのです。　へぇー

実例として、あの大腸菌O-114のゲノムを紹介していました。
PacBio、Ion Torrent、Illumina　等で読まれたデータのContigは、すべてOptical Mappingで作った制限酵素マップがカバーしていました。

現在はバクテリアサイズのゲノムに対応しているそうですが、本国ではヒトゲノムサイズのマップにも成功しているそうです。
最近のモントリオールの人類遺伝学会でも発表したそうですが、普通の（遺伝病などを持たないという意味でしょうが）白人男性の全ゲノムをこの制限酵素マッピング技術で読んで、既知のゲノム配列の制限酵素マップと比較した結果、なんと

• 22番長鎖に240kbのInsertion
• 8番短鎖に4.5MbのInversion

など、新しいゲノム変異が見つかったそうです。
こんなに大きな変異が普通にあったとしたら、今のリシークエンスに使っているUCSCのHG19とかの既知ゲノム配列って、何なんだろう、って思いました。
我々が「既知だ」、と思っているヒトゲノムのリファレンス配列が、人によって数メガ塩基の単位で異なるとしたら、 このリファレンス配列にReadをMappingしているだけでは、染色体の構造変化を見つけることはできません。
ドラフト配列だらけの非モデル生物ゲノムについては、言うまでもありません。

改めて、染色体構造を物理的に知ることの重要性を確認しました。

なお、この技術やマシンについては日立ソリューションズさんにお問い合わせください。
きっと親身に説明してくれると思います。

アメリエフ社 ２周年記念パーティー（＆勉強会）

SNP解析受託なら　アメリエフ株式会社

２ケ月に一回行っている勉強会、そして今回は創立２周年記念パーティーに行ってきました。
私は過去２回、勉強会に参加しているのですが、勉強はもちろん、その後の懇親会でいろいろな方と話ができるのがとても有意義に感じています。

今回は２周年のパーティーということもあり、イタリアンレストランでの立食パーティーでした。
偶然にも、私の知り合い、お客さんも数人いました。　業界狭いですね。

アカデミック、企業、の垣根を越えたつながり。
同業だろうと気にせずに、みんなでバイオインフォマティクスを盛り上げよう！
という、社長の山口さんの考えに、私は大変共感します。

実際、会に参加しているひとの中には、私も含め企業の方もたくさんいます。
ライバル会社同士の方もいます。でも、そんなのは関係なし。
お酒が入ればざっくばらんな話ができます。
参加者は（こう言っては失礼ですが）お偉いさんは殆どおりません。
みな、２０代から３０代、４０代の若手、いつも現場で汗かいている方々です。
変に気を使わなくても良いのがまたいいですね。

何人かの方が、私のこのブログをチェックされていました。
面等向かって言われると恥ずかしい・・・
ちゃんと書こう。

最後になりましたがこの場を借りて、アメリエフさん、２周年おめでとうございます！！
今後ともどうぞ宜しくお願いします。
ちょっと競合っぽくかぶるところもありますが、これからも飲み会、じゃなくって勉強会、誘ってください。

プレゼンの反省

この間、私の属する会社の主催でNGSの解析セミナーがありました。知っている方もいらっしゃると思います。

私の前のプレゼンターの方々が、フリーツールの使い方を述べ、商用ソフトCLC-Bioの紹介があり、さらにシーケンスメーカー３社のプレゼンあり、と、これだけでも充実していたと思います。

私のプレゼンは、会社の意向もあり、「数種類のマッピングソフトを使ったときのChIP-SeqとPeak Detection後の解釈」というものでした。　（ちなみに私の後は、「RNA-Seqとその後の機能解析」）

後の反省会で、いろいろ考えてしまいました。

質疑応答時間がなかったのは残念でした。　プレゼンしながら質問が飛んでくるようなスタイルが好きですが、大人数ではちょっと・・・無理ですね。　スケジュールの都合上とはいうものの、質問時間は取るべきでした。　フィードバックが得られないのは大変残念。　これは大失敗です。　

私のプレゼンの流れとしては、公共のChIP-Seqデータを落としてきて、これをHg18にマッピングして、Peak検出して、Peakを絞り込んで、絞込み後の近傍遺伝子をさらに絞り込んで、その近傍遺伝子の機能を調べて、という感じです。

マッピングソフトをBWAとBowtieとCLCの３種類を使って比較したのですが、いまいち伝わりませんでした。　前のプレゼンターが、BWAもBowtieもCLCも、パラメータなどを説明していたので私は省略したのですが、それがまずかった。　聞いている方は、適当にやった結果か？と疑問を抱いてしまうかもしれません。　やはり比較するならきちんとそのときのパラメータ条件を述べるべきだったでしょう。

というか、そもそも今回の場合、マッピングソフトを統一して、ChIP-Detectionソフトを変えて比較した方が、聞いている側からするともっとわかりやすかったかもしれません。　私も後でそれに気がついたのですが、プレゼンに間に合いませんでした。

プレゼンは本当に難しいです。　聞いている側の心に響く、印象に残る、メッセージを送らないといけませんね。

これは何のプレゼンなのか、をはっきりと示すことが大事です。

あと一回、明日同じ内容を喋らなければいけません。少し内容を変えました。ちょっとはわかりやすくなったかな。　

次やるときはもっとマニアックな、実践的な、実データを使った解析例をプレゼンしたいと思います。

お題は、・・・　得意な（？）、というか好きな、

1. RNA alternative splicing
2. Copy Number Variant detection
3. De novo transcriptome
4. Chromosomal translocation

がいいかな。　会社がOKくれればの話ですが。

これら４つは、普通の商用ソフトではかなり困難なものです。　でもフリーツールやメソッド自体はありますので不可能ではありません。　はてはて、どれに優先度を持っていくか。

Splicing variantはExon Array、CNVはSNP/CGH arrayという既存のテクノロジーがありますので、興味あるひとが多いでしょうか。　

De novo transcriptomeは、参照配列未知の生物のRNA-Seqという、次世代シーケンサーならではの解析ですし、個人的には大好きな分野です。

Chromosomal translocationは、最近面白いソフトを見つけました。　そのうちここでも紹介します。

BMB2010

分子生物学会が終わり、今年も終わりに近づいてきた。
暮れのこのイベントが、仲間の生存を確認するいい機会になっている。
今年も懐かしい顔に会えて、ほっとした。

昨年と比べ、次世代シーケンサーの結果を披露しているポスターが多かった。
と言っても全体に比べるとごくごく少数だが。　（全体数が多すぎるのか？）

種類別で言えば、まだまだ解析の方法論を述べているものが多い。
アンプリコンのシーケンスで特定配列のタイピングをしたもの。
2種類の生物のゲノムを読んでSNPを比べたもの。
エキソンスプライシングの差を特定していたもの。

個人的には、ゲノム構造（ヒストン構造などのエピゲノム）と遺伝子発現との関連をテーマにしている発表が興味深かった。　何十年も前から関連性は示唆されていたものの、これまでの技術では解明できなかった。　高速シーケンサー技術がこれを可能にするかもしれない。
僕は、1分子シーケンサーの登場こそが、真にシーケンサーによる解析のブレークスルーをもたらすと思う。
これについては、後日、ちゃんとまとめる。

さて、先日の書き込み、マッピングのところ、大切なことを忘れていたことに気が付いた。
僕はそれほど気にしていなかったのだが、ある方と話していて、気が付いた。

マッピングには、Gapを許すアルゴリズムと、Gapを許さないアルゴリズムがある。
Gapを許す方が、計算時間はかかるが、Insertion / Deletion の検出に向いている。
Gapを許さない方は、InDel検出には向いていないが、その分計算時間が短い。
フリーのツールでは、Bowtie、Soapが、Gapを許さない。
BWAがGapを許す。

また、リードをマッピングするときは、マッピングの前に、クオリティでトリミングすることがある。
塩基のクオリティは、リードの後ろほど低い。
50塩基のリードなら、ある程度、例えば40塩基まではクオリティが高くても、その後ガクンと落ちることがままある。
だから、マッピング前に、リードの後ろの方を削り落すことが大事なのだ。
大抵の有償ソフトには、デフォルトでその機能が付いているが、フリーのツールでは自分でパラメータを追加しないといけないことが多い。

一律に、後方10塩基を落とす、という方法なら、全部のリード長は同じになる。
でも、クオリティがXX未満の塩基があったらその後ろを落とす、という方法なら、リード長はまちまちだ。
そんなとき、リード長がまちまちでもマッピングできるのが、BWA。
BowtieとSoapは、リード長が全部同じでないとマッピングできない。
もちろん有償のソフトなら、リード長がまちまちでも問題無い。

さあ、ここまでが、マッピングで書き忘れていた大事なこと。

ところでDDBJ(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)でも、シーケンスの登録データベースがあるのをご存じだろうか？
そこの担当者とも話す機会があった。
DDBJにシーケンスデータをアップして、そのまま解析ができるパイプライン(ここ)を作ったそうだ。
今は、マッピングとアセンブルの機能はあるらしい。
もっと広く認知されれば、徐々にサーバーのスペックも上げていくらしい。今はまだ、同時アクセスを制限している状態、ら　し　い。